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高效液相色谱仪的结构和工作原理
发布时间:2019-11-27 11:10   点击次数:
高效液相色谱仪的结构和工作原理



(一)高效液相色谱仪工作原理、结构组成
 
 
高效液相色谱仪的工作原理:样品进入输液系统(泵) → 进样系统 → 分离系统(柱)→检测系统 → 数据处理系统→打印输出结果。
 
  工作原理图如下图所示:
 
 
(二)结构组成及各个部件的重要性
 
高效液相色谱仪一般都是由输液系统(泵) 、进样系统 、 分离系统(柱)、检测系统、数据处理系统组成。各部分简述如下:
 
1、输液系统(高压泵)及其重要性
 
  高压泵是关键部件之一,按原理分为两种类型:一类是恒流泵,一类是恒压泵。恒流泵,无论色谱柱的阻力如何变化、无论外界有何影响,它输出的流动相的流速可以基本保持不变,这正好是高效液相色谱仪系统工作的基本要求;而恒压泵输出的基本上是恒定不变的压力,在正常情况下,由于高效液相色谱仪系统的阻力不会变化,所以恒压也可以达到恒流的效果。但是由于色谱柱、温度等可能会有变化,所以可能导致流量变化,这是高效液相色谱仪使用者不希望看到的结果。所以一般来讲,恒流泵比恒压泵好(横流泵的使用多于恒压泵)。
 
  高压泵的质量直接影响整个高效液相色谱仪的质量,是用户关注的核心部件之一。高效液相色谱仪高压泵的重要性及使用者对高压泵的具体要求如下:
 
  (1)耐高压
 
  耐高压是高效液相色谱仪系统对高压泵的基本要求之一,一般来讲,平均粒径为4µm左右的填料、内径为5mm左右的色谱柱,当流动相流速为1-3mL/min时,要求输液泵的最高工作压力达到34.47-41.36Mpa(5000-6000psi);目前国际上商品HPLC泵的最高工作压力一般为41.36Mpa (5000psi)左右。
 
  (2)稳定性好、脉动小
 
  输液高压泵的稳定性和脉动大小会直接影响高效液相色谱仪系统的稳定性(漂移和重复性)、影响系统的噪声、降低灵敏度,特别是高效液相色谱仪系统采用电化学检测器和示差等检测器,或进行梯度分离时更加重要,因此目前国际上很多高压泵的压力脉动都可以控制在1%以内。
 
  (3) 流量连续可调、流量范围宽
 
  目前国际上高效液相色谱仪的高压泵,大多数流动范围可以达到0.001-10.0mL/min(制备色谱的流量更大,有时要求达到数千mL/min),可以同时满足各种不同内径的色谱柱的分析工作要求。
 
  (4) 流量重复性好
 
  很多高效液相色谱仪的泵的流量重复性可以达到0.07%(RSD)。但是重复性与测试方法有关,目前国际上一般采用两种方法测试:
一是重量法,收取泵的单位时间里的流出液,在天平上直接称其重量,判断重复性;
二是保留时间法,根据保留时间的长短,来判断流量的重复性。
高效液相色谱仪的分析工作中,其定性分析一般是根据保留时间。高压泵的重复性(RSD)是极其重要的指标之一,也是影响高效液相色谱仪整机系统重复性的一项非常重要的性能技术指标。
 
  (5)死体积小
 
  高压泵的死体积会影响高效液相色谱仪的分析精密度和准确度,特别是影响梯度洗脱的效果,一般总是希望死体积越小越好。因为高压泵的死体积小,有利于溶剂的快速置换,并且有利于把系统的气泡及时排出。
 
  (6) 流量准确度高
 
 高效液相色谱仪高压泵的流量准确度很重要,直接影响分析测试数据的重复性(可靠性)。目前国内外高效液相色谱仪的泵流量重复性一般在1%左右(与测试方法有关),最好的可达到0.06%。
 
  (7) 具有梯度洗脱功能
 
  目前国际上的高效液相色谱仪,一般都具有梯度洗脱功能;因为,往往等度洗脱不能解决的分析工作,如果采用梯度洗脱的方法,就可能很好的解决问题。因此,HPLC的使用者,往往需要仪器的高压泵具有流速程序和梯度洗脱程序。
 
  除上述几点外,对高效液相色谱仪的高压泵的要求还有耐用、流速可控程、具有压力检测保护功能、维修方便等。虽说不是所有的泵都要求具有上述要求,但是很多泵具有这些功能。
 
  2、分离系统(色谱柱)
 
  人们一般所讲的分离系统主要指色谱柱及其附件,它是一个非常重要、非常复杂的核心部分。一般液相色谱柱的结构如下图所示,包括柱管(大多采用不锈钢制作)、填料(后面将详细讨论)、接头(一般用不锈钢制作)、卡套(一般用不锈钢制作)、压帽、密封环、滤片、螺丝(一般用不锈钢制作)、连接管道(一般用不锈钢制作)等等。
 
  HPLC的色谱柱主体组成(结构)如下:
 
  1)色谱柱结构:色谱柱主体组成一般如下图所示:
 
 
图中:1-色谱柱的塑料保护头;2-柱头螺丝;3-刃环;4-密封环;5-滤片(筛板);6-柱体(不锈钢管);7-色谱柱填料。
 
  色谱柱的筛板(过滤板)一般是用不锈钢或钛合金材料制作,其孔径一般在0.2-20μm之间,孔径大小主要取决于柱填料的粒度,它是一个非常重要的零件,它可以防止填料漏出。同时,防止色谱柱工作时杂质进入柱内引起分离效果下降,甚至容易引起色谱柱堵塞等等。色谱柱与输液管连接处一般需要使用不锈钢制作的卡套和不锈钢制作的固紧接头螺钉,它们也非常重要,否则色谱柱系统会漏液,结果使柱压下降、流动相或样品漏出,严重影响分析测试结果,甚至不能进行分析测试工作。
 
  2)色谱柱分类:
 
  从类型上来说,色谱柱可以分为制备型和分析型两大类,一般分析型的柱使用最多。如果细分,色谱柱又可以分为常规柱、窄径柱、毛细管柱、制备柱和半制备柱等等。为提高分析速度,有人经常使用短柱,其柱长5-10cm,填料粒径多为3μm左右。很多分析工作者比较强调分析灵敏度,因此发展了窄径柱、毛细管柱和微径柱。这些柱子的优点是:所需样品少、所需流动相少、灵敏度高、容易控制温度。但是它们对检测器的流动池、柱外的管道、接头、进样阀等要求大大提高了。
 
  色谱柱的柱效是最重要的关键指标,一般都取决于固定相的性能和装柱技术。一般高效液相色谱仪色谱柱固定相(填料)大致有三种:硅胶或以硅胶为基质的填料、聚合物填料和无机物填料。正相色谱柱大多采用硅胶类填料,反相色谱柱则多以硅胶为基质组成的官能团类的填料。以聚合物为填料的色谱柱最大的特点是PH值可在1-14之间都能用,疏水性强。但无机填料色谱柱一般只是限于特殊用途,比较少用。
 
  因为高效液相色谱仪的样品都为溶液,而溶液受温度影响很大,例如:温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的柱效、流动相的粘度都会产生影响。如果温度升高,可能会提高溶液在流动相中的溶解度,可以降低分配系数K;降低流动相粘度可以降低柱压,有利于保护色谱柱,延长色谱柱的寿命。但是,温度不能太高,否则会产生气泡。
 
  高效液相色谱仪工作者还必须注意不同的温度,对色谱柱的保留时间、分离效果,及检测器的灵敏度都会有影响,特别是对示差折光器的灵敏度、最小检出限的影响很大。
 
  高效液相色谱仪的色谱柱(分离柱)是极其重要的部件之一,根据填料的不同一般可分为:反相柱、正相柱、其它柱三类,分别简述如下。
 
  (1)反相色谱柱:它是使用最多的一种色谱柱;一般约占75%左右; 其中,C18柱约占 65%;C8柱占15%左右;苯基柱<5%。反相色谱是目前应用得最为广泛的一种高效液相色谱方法。C18 在反相色谱中应用得最为广泛,大概超过一半以上。
 
  (2)正相色谱柱:正相色谱柱也经常被使用,约占20%左右。
 
  (3)其它色谱柱 (手性柱, 离子交换柱): 约占10%左右。
 
  要用好、保护好色谱柱,是一个需要特别重视的问题,如果稍有不慎,就有可能降低色谱柱的柱效、缩短色谱柱的寿命,甚至损坏色谱柱。
 
  3、检测系统
 
  检测器种类很多也非常重要,但是使用最多的是光学类检测器,占比约75%左右,这里重点光学类检测器。
 
  1)光学类检测器基本功能:提供准确的波长、提供足够小的检测限(灵敏度,这是用户最关心的问题之一)、提供小的噪声、飘移和重复性,给出最终检测结果。
 
  2)最常用高效液相色谱仪检测器的类型
 
  目前,国内外最常用的检测器有以下几种:蒸发光检测器、分子荧光检测器、示差折光检测器、各类紫外可见光谱检测器、各类质谱检测器、各类AAS(原子吸收光谱)检测器、各类原子荧光检测器等等。在各类联用技术中,凡与高效液相色谱仪的泵、柱联用的仪器,都可以称之为检测器。
 
  3)光学类检测器的主要技术指标:
 
  光学类检测器是所有检测器中使用最多的一种,它的主要技术指标如下:
 
  (1)波长范围:长波和短波两端决定仪器的适用范围,限制或决定仪器的适用性。例如:一般只有氘灯的紫外检测器,就不能测试吸收峰在618nm的强致癌物质孔雀石绿,以及吸收峰在200nm的紫外吸收物质,因为氘灯没有618nm这根谱线,而在200nm时能量弱、信噪比差。
 
  (2)波长准确度:影响摩尔吸光系数、影响仪器的灵敏度,比较仪器时很重要。
 
  (3)波长重复性:影响分析数据的重复性。
 
  (4)光谱带宽:大家不大注意,它是分析误差来源之一,一般采用谱线轮毂法测试。
 
  (5)噪声:非常重要,一般光谱仪器有多大的噪声,就可能在测试结果中增加多大的误差。
 
  (6)稳定性(含漂移、重复性):它直接限制光谱仪器的可靠性。
 
  (7)光度范围:应该注意多少浓度范围内能给出准确数据。
 
  (8)量程:应重视最灵敏量程,不能用最大量程测试仪器的灵敏度(后面将有论述)。
 
  4) 几种特别值得重视的高效液相色谱仪检测器
 
  (1)最常用的:紫外检测器(UVD)(占70%左右)、荧光检测器(FLD)(占10%) 、视差折光检测器(RID )(占3%)、其他检测器(如质谱等等,占17%)。
 
  (2)还有目前使用非常多的、质量型检测器:蒸发光散射检测器--ELSD, (已上药典,可以替代RID)。
 
  (3)用户目前特别关注的新型检测器:质谱检测器、化学发光检测器、放射性检测器、光电导检测器、旋光检测器、电喷雾检测器(最新的质量检测器,后面还将详细讨论)等等。
 

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